El trasplante de células madre de espermatogonias en Rhesus testículos regenera la espermatogénesis producir esperma funcional

Resumen

Las células madre de espermatogonias (SSC) mantener la espermatogénesis durante toda la vida de un hombre y puede tener aplicación en el tratamiento de algunos casos de infertilidad masculina, incluidos los causados por la quimioterapia antes de la pubertad. Se realizó trasplantes autólogos y alogénicos SSC en los testículos de los 18 adultos y 5 macacos receptores prepúberes que fueron prestados infértiles con la alquilación de la quimioterapia. Después del trasplante autólogo, el genotipo de los donantes de las ESC lentivirus-marcada fue evidente en los espermatozoides eyaculados de 9/12 y 3/5 de adultos receptores prepúberes después de llegar a la madurez. trasplante alogénico llevó a quimerismo donante-receptor en el esperma de 2/6 receptores adultos. esperma eyaculado de un receptor trasplantado con SSC donantes alogénicos se inyectaron en 85 ovocitos rhesus mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides.Ochenta y un ovocitos fueron fecundados, la producción de embriones que van de 4 celdas de blastocisto con origen paterno donante confirmado en 7/81 embriones. Esta demostración de la espermatogénesis donante funcional tras el trasplante en primates SSC es un hito importante para la traducción clínica informada.

Introducción

En 1994, Ralph Brinster y colegas trasplantaron células madre de ratón espermatogonias (SSC) en los túbulos seminíferos de los ratones receptores infértiles y la espermatogénesis derivadas del donante observado que era competente para producir progenie viable ( Brinster y Avarbock, 1994 ; Brinster y Zimmermann, 1994 ). Desde SSC trasplante se ha convertido en el bioensayo estándar de oro para la evaluación experimental de la actividad de SSC ( Phillips et al., 2010 ) y también puede tener aplicación en la clínica de fertilidad humana. Una posible aplicación clínica del trasplante de SSC es preservar y restaurar la fertilidad de los sobrevivientes de cáncer de sexo masculino ( Kubota y Brinster de 2006 ; . Geens et al, 2008; . Schlatt et al, 2009 ; . Wyns et al, 2010 ; Hermann y Orwig, 2011 ).

Quimioterapia y radiación tratamientos para el cáncer u otras condiciones pueden dañar de forma permanente la fertilidad ( Mitchell et al., 2009 ). Pacientes varones adultos tienen la opción de preservar su fertilidad en el futuro por el esperma crioconservación. Por desgracia, no hay opciones estándar de atención para preservar la fertilidad de los niños prepúberes que aún no están produciendo espermatozoides maduros. Para estos pacientes, puede ser posible aislar y congelar las ESC obtenida a través de la biopsia testicular antes de la terapia y tener gonadotóxicos estas células reintroducidas en sus testículos después de la curación ( Brinster, 2007 ; Clark et al., 2011 ). Si los resultados en modelos animales se traducen en la clínica, este paradigma trasplante autólogo puede restaurar la fertilidad natural de forma permanente. La viabilidad de este enfoque es apoyado por observaciones en modelos animales más bajos que los SSC de donantes de todas las edades, recién nacidos hasta adultos, se puede regenerar la espermatogénesis ( Shinohara et al., 2001 ; . Ryu et al, 2003 ) y que las ESC puede ser criopreservados y retener función espermatogénica tras la descongelación y el trasplante ( Dobrinski et al., 1999 ; . Dobrinski et al, 2000 ; Brinster, 2002 ).

Modelos animales grandes son críticos para examinar la seguridad y la viabilidad de las terapias experimentales antes de que sean traducidos a la clínica. El trasplante SSC se ha informado en siete estudios con animales grandes anteriores ( Tabla S1 ). Todos esos estudios, excepto uno en el jabalí ( Mikkola et al., 2006 ), la irradiación utilizada para combatir la espermatogénesis y causan infertilidad. Hay una escasez de información sobre la eficacia del trasplante de SSC en grandes animales tratados con quimioterapia, probablemente debido a los importantes desafíos asociados con el manejo clínico de los animales tratados sistémicamente con quimioterapias a dosis altas que causan déficits hematopoyéticas graves ( Hermann et al., 2007 ). Sin embargo, la importancia de este paradigma experimental no debe pasarse por alto debido a altas dosis de quimioterapia alquilantes se utilizan habitualmente para el acondicionamiento previo de células madre hematopoyéticas trasplante (HSC) y se asocian con un alto riesgo de infertilidad ( Wallace et al., 2005; Lee et al., 2006 ; Mitchell et al., 2009 ; Green et al., 2010 ).

Los primeros grandes trasplantes de animales SSC se llevaron a cabo en monos por Schlatt y sus colegas (verTabla S1 ), que describe los trasplantes autólogos en receptores de mono irradiados en 2002 y nuevamente en 2011 ( Schlatt et al., 2002 ; Jahnukainen et al., 2011 ). Cada estudio informó que el testículo derecho trasplantado era más grande que el testículo izquierdo trasplantado-un en un animal, pero no se evaluó la presencia o la función de un donante de esperma. Por lo tanto, la cuestión de si el trasplante SSC puede ser traducido al sistema de primates y producen esperma funcional sigue siendo. La importancia de la traducción de esta pregunta es alto debido a las clínicas de todo el mundo ( Keros et al., 2007 ; Wyns et al., 2008 ;Ginsberg et al., 2010 ; Sadri-Ardekani et al., 2011 ; Oktay de 2011 ; Orwig et al., 2011 ; Schlatt y Kliesch de 2012 ) ya son el tejido testicular criopreservar para los niños en previsión de que las SSC en que el tejido se puede utilizar para restaurar la fertilidad a través de un trasplante SSC autólogo, injerto de tejido autólogo, los xenoinjertos o in vitro diferenciación de células germinales ( Brinster, 2007 ; Rodríguez-Sosa y Dobrinski de 2009 ; Sato et al., 2011 ; Clark et al., 2011 ). El establecimiento de la viabilidad del trasplante de SSC en el modelo de primate tendrá importantes implicaciones para la forma del tejido testicular deben procesarse y para educar a los pacientes y médicos sobre las posibles aplicaciones posteriores.

Hemos descrito previamente un modelo de primates no humanos de la supervivencia del cáncer en macacos rhesus, donde la infertilidad fue causado por alquilación de la quimioterapia (busulfán) ( Hermann et al., 2007 ). Empleamos ese modelo en el estudio actual para examinar la viabilidad del trasplante de la CSS en prepúberes y adultas macacos rhesus, que tienen la biología testículo, la regulación endocrina y la función inmune que es similar a los seres humanos ( Planta y Marshall, 2001 ; . Hermann et al, 2010 ; Messaoudi et al., 2011 ). Autólogo de células madre de sangre periférica (CMSP) de trasplante profiláctica ( Donahue et al., 2005 ; . Kang et al, 2006 ) se utilizó para contrarrestar los déficits hematopoyéticas en todos los animales.Este diseño experimental complejo que implica modelos de trasplante de HSC SSC y el escenario clínico de células madre hematopoyéticas (médula ósea o trasplante de CMSP) de los pacientes que están en alto riesgo de infertilidad ( Wyns et al., 2010 ). Nuestros resultados indican que las SSC trasplantadas pueden regenerar la espermatogénesis en los primates busulfán-tratado y producir esperma funcional capaz de fecundar los ovocitos y que conduce al desarrollo del embrión preimplantatorio.

El trasplante SSC mediante inyección rete testis guiada por ultrasonido en monos

Schlatt y compañeros de trabajo fueron pioneros en la inyección rete testis guiada por ultrasonido en los testículos de mono en 1999 ( Schlatt et al., 1999 ) y esta técnica se ha aplicado para introducir las suspensiones de células de testículo en los túbulos seminíferos de varias especies de animales grandes (Schlatt et al ., 1999 ; Schlatt et al., 2002 ; . Honaramooz et al, 2003 ; . Izadyar et al, 2003 ; Mikkola et al., 2006 ; . Kim et al, 2008 ; . Herrid et al, 2009 ). En contraste con un trasplante de roedor SSC típico en el que se accede a los conductos eferentes testículo y / o los testículos rete quirúrgicamente a través de una incisión abdominal ( Ogawa, 2001 ), inyección rete testis guiada por ultrasonido no requiere cirugía. Brevemente, el ultrasonido se utiliza para visualizar la rete testis y guiar la aguja de inyección a través de la piel del escroto y en el espacio rete testis, que es contigua con todos los túbulos seminíferos ( Figura 1 y la película S1 ). Con este enfoque, hemos introducido un promedio de 1041 ± 82 l de suspensión celular en la rete testis y los túbulos seminíferos de los receptores adultos y 222 ± 26 l en receptores de menores. Las concentraciones de células variaron desde 58 hasta 232 x 10 6 células viables / ml; un promedio de 88 × 10 6 células viables se inyectaron por testículos adultos y 45,8 × 10 6 Se inyectaron células viables por testículo juvenil ( Tabla S2 ).

Figure 1 - Ultrasound-guided rete testis injection
Fig 1. Rhesus SSC trasplante mediante inyección rete testis guiada por ultrasonido

SSC autólogas trasplantadas producen la espermatogénesis en macacos tratados con busulfán

Para evaluar la capacidad de regeneración de las ESC primates, hemos realizado una serie de experimentos de trasplante autólogo en macacos tratados con busulfán ( Hermann et al., 2007 ). Debido a que las dosis de busulfán necesarios para agotar la espermatogénesis endógena son también mielosupresora, todos los animales recibieron trasplantes de CMSP autólogas para apoyar la rápida recuperación hematopoyética ( Figura 2 ). Se obtuvieron células de los testículos mediante hemicastration o biopsia de un testículo y criopreservados antes de la quimioterapia busulfan.

Fig 2. Experimental línea de tiempo para la preparación del receptor y trasplantes SSC
Fig 2. Experimental línea de tiempo para la preparación del receptor y trasplantes SSC

Con el fin de distinguir las ESC trasplantado y su progenie de células endógenas se trataron las células del donante con vectores lentivirales que contienen ubiquitina-C (UBC) EGFP, factor de elongación 1α (EF1α)-GFP o insertos transgénicos EF1α-mCherry ( Tabla S2 ) antes del trasplante . Este enfoque marca de forma permanente las células del donante y permite la detección de las células del donante marcadas en el tejido o esperma eyaculado por su genotipo (por ejemplo, una secuencia de ADN lentiviral específico).

Aproximadamente 10 a 12 semanas después del tratamiento busulfán (que corresponde al momento en que el número de espermatozoides llegan a 0 en adultos), se descongelaron las células, se trató con lentivirus y transplantado de nuevo en el otro testículo del mismo animal ( Figura 2 ). Lentivirus-SSC tratados autólogas fueron trasplantadas en los túbulos seminíferos de 12 adultos y 5 macacos receptores prepúberes por inyección rete testis guiada por ultrasonido. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para detectar esperma producido a partir de los SSC lentivirus señalizados con los eyaculados de animales receptores. En general, la espermatogénesis fue evidente en adultos y 11/12 5/5 prepuberal (después de la pubertad) receptores después del trasplante ( Figura 3A y Tablas S2S4 ).

Fig 3. la recuperación de la espermatogénesis después de un trasplante autólogo SSC
Fig 3. la recuperación de la espermatogénesis después de un trasplante autólogo SSC

La duración de la espermatogénesis, de SSC a los espermatozoides es de aproximadamente 42-44 días, seguido de 10,5 días de tiempo de transporte del epidídimo ( Amann et al., 1976 ; Clermont y Antar, 1973 ;Hermann et al., 2010 ). La recuperación de la espermatogénesis a los niveles normales (≥ 15 × 10 6 ) se observaron en los receptores adultas autólogas un promedio de 40,1 ± 4,9 semanas después del tratamiento busulfán (11 de 12 adultos; varió de 15 a 63 semanas, Tabla S3 ). En nuestro estudio anterior, la recuperación de la espermatogénesis de las ESC endógenos se produjo a las 24 semanas después de una dosis baja de busulfán (4 mg / kg) que no eliminar las ESC endógenas; la recuperación de la espermatogénesis no se observó en los animales tratados con las dosis más altas de busulfán (8 y 12 mg / kg) empleados en este estudio ( Hermann et al., 2007 ). El tiempo de recuperación de la espermatogénesis en este estudio probablemente se puede atribuir al agotamiento sustancial de la piscina SSC endógeno, que no está completamente repuesta por SSC trasplantado. Por lo tanto, la espermatogénesis se origina a partir de focos esporádica de endógeno individual y / o las ESC trasplantados que debe expandirse lateralmente para repoblar los túbulos seminíferos, así como diferenciarse para producir esperma. Estos factores aparentemente prolongan el tiempo requerido para alcanzar un umbral de estado estacionario, suficiente para producir el número de espermatozoides normales en el eyaculado.

PCR genotipo de la columna vertebral lentiviral indica la señal de donantes estable en los eyaculados de 9/12 y 3/5 de adultos receptores autólogas prepúberes ( Figura 3B , Tablas S2S4 ). Señal de donante se considera estable cuando se observó genotipo lentiviral en al menos cuatro muestras diferentes de semen recogidos a lo largo de al menos tres meses. Los resultados de receptor autólogo M037 se muestran en la Figura 3 donde el esperma re-aparecieron en el eyaculado entre 20 y 30 semanas después del trasplante ( Figura 3A ). Secuencia donadora de lentiviral se detectó por PCR coincidente con la aparición de esperma ( Figura 3B ). En general, la señal de PCR a partir de lentivirus marcada SSC decayó con el tiempo (verTablas S3S4 ), lo que sugiere una baja eficiencia de marcado virus injerto SSC. Comparación histológica de los testículos y de la cola de epidídimo de M037 ( Figura 3C ) demuestra claramente más la recuperación de la espermatogénesis (60% de los túbulos seminíferos secciones transversales contenía la espermatogénesis) en comparación con un receptor de trasplante que no pudo presentar espermatozoides en el eyaculado después del trasplante (M214; figura 3D ) y tenía la espermatogénesis en sólo el 24% de los túbulos secciones transversales. Para referencia, todos los túbulos seminíferos estaban desprovistos de células germinales en un animal tratado con busulfán que no recibió trasplante de 26 semanas después del tratamiento busulfán (M104; Figura 3E ). No hemos podido observar segmentos fluorescentes de túbulos seminíferos (es decir, marcado por el lentivirus y la espermatogénesis regenerado) después de una evaluación sistemática de cada destinatario autólogo testículo en la necropsia por microscopía de epifluorescencia. El fracaso para observar la expresión de reportero lentiviral puede resultar de silenciamiento epigenético del transgén, la insuficiente expresión para este modo de detección, o ambas cosas.

La mejor manera de demostrar que las SSC trasplantadas producen esperma funcional es demostrar su capacidad de fecundar los ovocitos. Desafortunadamente, nuestro enfoque trasplante autólogo no era susceptible de estudios de fertilización porque la eficiencia de las ESC marcado fue muy baja (datos no mostrados). Además, no fuimos capaces de distinguir la fluorescencia de lentivirus marcada esperma de autofluorescencia que se observó en la mayoría de los eyaculados (datos no mostrados). La fertilización de ovocitos de una población aleatoria de esperma de los que sólo un porcentaje muy pequeño se caracterizaron genéticamente no era práctico. Por lo tanto, hemos realizado experimentos adicionales utilizando un enfoque receptor alogénico en la que todos los donantes de esperma tenía perfiles de los alelos de microsatélites de ADN únicas que podían distinguirse de los espermatozoides receptor endógeno.

SSC alogénicas trasplantadas regeneran la espermatogénesis y producen esperma funcional

Hemos utilizado un paradigma donde el trasplante alogénico de células de testículos de donantes no relacionados animales individuales fueron trasplantadas en los testículos receptores. Mientras que algunos informes previos demostraron que las células testiculares alogénicas trasplantadas eran toleradas en modelos animales grandes que permiten el injerto de las ESC de donantes no emparentados ( Honaramooz et al., 2002; Honaramooz et al., 2003 ; . Kim et al, 2008 ), las ESC de donantes no relacionados fallidos para regenerar la espermatogénesis en los testículos de toro ( Izadyar et al., 2003 ) ( Tabla S1 ). Por lo tanto, el potencial de efectos inmunes en SSC injerto no son claros. Por lo tanto, los pares de donantes y receptores fueron agrupados en base a la reactividad baja receptor de las células T a los antígenos del donante utilizando la reacción linfocitaria múltiple (MLR; datos no mostrados) Análisis ( Ezzelarab et al., 2008 ). Además, 5 de 6 receptores alogénicos fueron tratados con un régimen de supresión inmune (anti-CD154; Tabla S2 ) ( Kirk et al., 1999 ). Discriminamos esperma procedente de donantes y receptores SSC utilizando la huella dactilar de microsatélites, como se ha descrito anteriormente para detectar la producción de esperma de donantes en los perros trasplantados-SSC ( Kim et al., 2008 ).

Todos los seis receptores alogénicos presentaban menor grado de recuperación de la espermatogénesis en el periodo post-trasplante de evaluación ( Figura 4A y Tablas S2S3 ). La huella de ADN de microsatélites reveló quimerismo del donante / receptor en el esperma de dos de los seis receptores alogénicos (M212 y M027, el cuadro S2S3 ). Los espermatozoides obtenidos del epidídimo cauda izquierda en la necropsia de los animales M212 exhibió un pico menor de la señal de los donantes (donante M214; 236bp y 244bp alelos en el locus DS11S2002; 194bp y 244bp alelos en el locus D12S67) en medio de un contexto de recuperación de la espermatogénesis endógena ( Figura 4b- D ). Señal de donante no era detectable en el esperma eyaculado de M212 probablemente debido a la inflamación en el epidídimo izquierdo evidentes en el periodo post-trasplante y confirmó en la autopsia, impidiendo el tránsito de esperma de donantes a que el eyaculado (datos no mostrados). Un segundo receptor alogénico, M027, producido eyaculado espermatozoides que presentan señales de donantes (donante M092; alelo 187bp en el locus D3S1768; alelo 263bp en el locus D17S1300) durante más de 17 meses (50 muestras en total) con el análisis en curso en el momento de la presentación de manuscritos ( Figura 4E-G ). Por lo tanto, estos datos muestran que las SSC alogénicas trasplantadas producen esperma en los testículos receptores. Para cuantificar el grado de la producción de esperma de donantes en función del tiempo, se identificaron polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que distinguen esperma de donantes de esperma receptor esencialmente como se describe anteriormente (Alizadeh et al., 2002 ; Kim et al., 2008 ). Se seleccionaron 23 SNPs reportados en la base de datos del mono SNP en la Oregon Nacional Centro de Investigación de Primates (monkeysnp.ohsu.edu), pero ninguno distinguida donante y el receptor y / o fueron adecuados para la qPCR. Sin embargo, mientras que el cribado reportado SNP (rs4543622) dentro de la clase II de histocompatibilidad principal transactivador compleja (CIITA) locus, hemos identificado un SNP antes publicados por la que el destinatario (M027) fue homocigotos para un alelo (G) y el donante (M092) heterocigotos ambos alelos (A / G). Las curvas de calibración para la abundancia relativa de cada alelo como se describe previamente se han utilizado para determinar el porcentaje de quimerismo del donante en el ADN aisladas de destinatario M027 siguientes muestras mensuales esperma recogido entre los 3 y 17 meses después del trasplante ( Fig. 4H ). Se observó un nivel constante de donantes quimerismo (M092) (que van desde 1,7 hasta 17,2%) en muestras de esperma M027 para la duración de los 14 meses analizados ( Fig. 4 ).

Fig 4. espermatogénesis donantes en dos receptores de trasplante alogénico determinada por la huella de ADN microsatélite de espermatozoides destinatario
Fig 4. espermatogénesis donantes en dos receptores de trasplante alogénico determinada por la huella de ADN microsatélite de espermatozoides destinatario

 Para evaluar la función del donante de esperma (M092), eyaculado espermatozoides de receptor M027 (recogido 30 semanas después del trasplante) fueron utilizados para fecundar los ovocitos rhesus por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ( Hewitson et al., 1999 ; . Mitalipov et al, 2006 ) .De 85 oocitos inyectados, 81 (95%) fueron fertilizados (pronúcleos femenino formado masculinos y) y subsiguientemente cortado ( Figura 5 , Tabla S5 ). Tras in vitro de cultivo, el 23% de los embriones llegó a la etapa de blastocisto con morfología normal ( cuadro S5 ). Para determinar toro por las huellas de ADN microsatélite, todos los blastocistos y embriones detenidos fueron cosechadas por separado y utilizados para la amplificación del ADN del genoma completo. La genotipificación se hace para el AME indicador de género para determinar el sexo de embrión y de 8 loci de microsatélites, dos de los cuales (DXS2506 y D15S823) definitivamente discriminar el genotipo del donante SSC (M092) desde el receptor del trasplante (M027), así como de los ovocitos donantes ( Figura 5 y Tabla S6 ). En este paradigma de genotipado, el alelo 286bp en el ligada al cromosoma X DXS2506 locus y el alelo 337bp en el locus D15S823 estaban ambos única para M092 y su presencia en un embrión sólo podría surgir de M092 contribución paterna ( Figura 5 yTabla S6 ). De los 81 embriones genotipo, 7 exhibieron sire definitiva donante (M092), tres de los cuales avanzó a la fase de mórula de desarrollo de preimplantación ( Figura 5 y Tabla S6 ). Desde DXS2506 es un marcador ligado al cromosoma X, de sexo masculino (XY), los embriones muestran sólo el alelo materno en este locus, incluyendo 3 embriones engendrados-M092 XY (embriones 1, 8 y 63, Figura 5L y 5O , el cuadro S6 ). Donante M092 contribución paterna en estos embriones se confirmó por la presencia del alelo 337bp en el locus D15S823. Estos resultados indican que los espermatozoides generado a partir de los SSC de primates trasplantados son competentes para el desarrollo de la fertilización y la preimplantación de embriones.

Fig 5. un donante de esperma derivado en macacos rhesus receptor alogénico son funcionales.
Fig 5. un donante de esperma derivado en macacos rhesus receptor alogénico son funcionales.

Discusión

Tejido adulto trasplante de células madre para la regeneración de tejidos homóloga fue descrito primero por primates en la década de 1950 cuando se utilizaron células madre de médula ósea para reconstituir los sistemas hematopoyéticos de monos y seres humanos tratados con quimioterapia o radiación ( Crouch y Overman, 1957 ; . Thomas et al, 1957 ). Los animales grandes, principalmente el perro y el mono, fueron fundamentales para el establecimiento de la seguridad, la viabilidad y la gama de aplicaciones para el trasplante de médula ósea. Hoy en día, aproximadamente 50.000 médula ósea o los procedimientos de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC) se llevan a cabo en todo el mundo cada año por enfermedades que van desde el cáncer a la talasemia, anemia de células falciformes, trastornos autoinmunes e-deficiencia inmunológica ( Appelbaum FR 2007 ; Powell et al. de 2009 ).

Al igual que la hematopoyesis, la espermatogénesis es un sistema basado en células madre altamente productiva que produce millones de espermatozoides por gramo de tejido cada día ( Sharpe, 1994 ). Esta productividad es posible porque un grupo de células madre relativamente pequeño genera una progenie que se someten a varias rondas de divisiones de tránsito de amplificación antes de producir el esperma terminales diferenciadas ( Potten, 1992 ). Dos secuelas de los sistemas basados en células madre altamente productivas son 1) que pueden convertirse en objetivos de los tratamientos de quimioterapia o radiación que dañan células de división rápida ( Potten, 1995 ; Meistrich de 1993 ; . Mauch y otros, 1995 ) y 2) que el trasplante de un pequeño número de células madre es adecuado para reconstituir funcionalmente los sistemas dependientes (por ejemplo, la hematopoyesis y la espermatogénesis) ( Potten et al., 1979 ; Potten, 1992 ;Osawa et al., 1996 ; Ogawa et al., 2000 ; Shinohara et al ., 2001 ; Copelan de 2006 ). Aquí se demuestra la viabilidad del trasplante de SSC en un modelo de primate no humano que es estéril debido a la quimioterapia alquilante (busulfán) y sugieren que esta técnica tiene aplicación para la restauración de la fertilidad de los supervivientes del cáncer o los receptores de trasplante de médula ósea.

El trasplante SSC ahora se ha informado en ratones, ratas, monos, cabras, toros, cerdos, ovejas y perros (Brinster y Avarbock, 1994 ; Brinster y Zimmermann, 1994 ; Ogawa et al., 1999 ; Schlatt et al., 2002 ;Honaramooz et al., 2003 ; . Izadyar et al, 2003 ; Mikkola et al., 2006 ; . Kim et al, 2008 ; . Herrid et al, 2009). Entre los otros siete estudios de trasplante de animales grandes SSC revisados en la Tabla S1 , cuatro informaron evidencia de un donante de esperma en la eyaculación (cabra, jabalí, perro, oveja) y dos informaron de esperma funcional (cabras y ovejas) que produjo la progenie derivada de donantes. A pesar de que se realizaron los primeros trasplantes de animales grandes SSC en monos en 2002 ( Schlatt et al., 2002 ), la evidencia de un donante de esperma de las ESC trasplantado faltaba hasta que el presente estudio. Es importante demostrar que las SSC trasplantadas pueden producir esperma en modelos de primates superiores que tienen la mayor relevancia a la anatomía y la fisiología testículo humano. Es igualmente importante demostrar que los primates en el medio ambiente testicular es competente para soportar la espermatogénesis de las ESC trasplantados después de la quimioterapia o la radiación. Schlatt y sus colegas informaron previamente trasplante de SSC en primates no humanos que fueron infértil por irradiación testicular ( Schlatt et al., 2002 ; . Jahnukainen et al, 2011 ). Hasta la fecha, SSC trasplante en un receptor animal grande quimioterapia tratados sólo se ha reportado en el cerdo ( Mikkola et al., 2006 ). Nuestros resultados indican que las ESC de macacos rhesus prepúberes o adulto se injertan testículos receptores tratados con quimioterapia y generar la espermatogénesis, incluyendo la producción de esperma de un donante que era competente para fecundar los ovocitos rhesus que resulta en el desarrollo del embrión antes de la implantación.

Hemos encontrado pruebas de la espermatogénesis donante se evaluó de ambos receptores de trasplantes autólogos y alogénicos y la función del esperma de donantes en un receptor alogénico (M027, el destinatario de las ESC trasplantados de M092). Espermatogénesis en los receptores de donantes autólogos fue generalmente transitorios en muestras de semen receptores, que aparece varias veces durante el post-trasplante de seguimiento y, a veces de una manera cíclica. Este resultado podría estar relacionado con una baja eficiencia de injerto de las ESC donantes marcada por virus. Receptor alogénico M027, por el contrario, demostró la espermatogénesis donante constante que no disminuyeron con el tiempo. La función del donante de esperma (M092) en los eyaculados de receptor M027 (que contenía una mezcla de M092 y M027 espermatozoides) se evaluó mediante la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) de ovocitos rhesus y se llevó a cabo en la tecnología de reproducción asistida / embrionaria, apoyo de células madre núcleo del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregon (KM, CR y SM). In vitro (FIV) es un enfoque alternativo para probar la función espermática que también evaluar la capacidad de un donante de esperma para penetrar la zona pelúcida. La eficacia de la FIV ICSI es similar a cuando se utiliza el esperma de donantes varones probados. Sin embargo, ya que los machos utilizados en este estudio no se han demostrado los criadores, ICSI fue seleccionado como el enfoque más probabilidades de producir un resultado definitivo con embriones derivados del donante. El enfoque ICSI también elimina la posibilidad de contaminación de los resultados de genotipado con una mezcla de donante y receptor de esperma endógeno.La capacidad de los espermatozoides de donantes derivada SSC-M092 para fertilizar ovocitos rhesus por ICSI y estimular el desarrollo temprano del embrión sugiere que eran funcionalmente normal.

En estudios futuros será importante para demostrar que los embriones derivadas del donante pueden ser transferidos a hembras sustitutas para la producción de descendencia viable derivadas del donante. Esta fue considerada prematura en el presente estudio, ya que sólo 7/81 embriones (8,6%, Tablas S5S6 ) tenían el genotipo del donante. La biopsia de embriones para seleccionar sólo los embriones de tipo donante para la transferencia no se consideró factible (SM) y las tasas de embarazo después de la transferencia son alrededor del 25% ( Bavister et al., 1984 ; . Wolf et al, 1989 ; . Chan et al, 2001 ; Wolf et al., 2004 ). Por lo tanto, las posibilidades de lograr la progenie tipo de donante sería de alrededor de 2,15% (8,6% embriones de donantes × 25% la tasa de embarazo). Además del costo prohibitivo, había un número insuficiente de hembras receptoras disponibles esperar razonablemente los hijos de donantes en este estudio. Estos desafíos eran menos onerosas en las especies animales del rebaño donde un solo receptor de trasplante SSC podría utilizarse para fertilizar una manada de hembras por reproducción natural ( Honaramooz et al., 2003 ) o la inseminación artificial ( Herrid et al., 2009 ). Las mejoras en la preparación de receptor para eliminar de forma más completa la espermatogénesis endógena, combinado con el desarrollo de estrategias SSC donante de enriquecimiento ( Hermann et al., 2009 ; Hermann et al., 2011 ) debería aumentar sustancialmente la proporción de esperma de donantes y mejorar la oportunidad de producir hijos de donantes en futuros estudios de primates no humanos.

Debido a las preocupaciones sobre el rechazo inmune de las células de animales no relacionados, cinco de los seis receptores de trasplantes alogénicos en este estudio fueron tratados con anticuerpos contra CD154 (Kirk et al., 1999 ), que bloquea la vía de co-estimuladoras de células T. Se observó la espermatogénesis donantes en 2/5 receptores inmunes suprimidos, pero no en el de un destinatario no suprimida ( Tabla S2 ). A partir de la meiosis, espermatocitos y su progenie expresar nuevos autoantígenos que son toleradas por el sistema inmune, lo que permite la producción de gametos genéticamente divergentes. Múltiples mecanismos regulan el privilegio inmune en el testículo incluyendo la barrera sangre-testículo que limita el acceso de los componentes inmunes a las células germinales diferenciadas a través de células de Sertoli uniones estrechas, y la producción de células somáticas de factores solubles (por ejemplo, FAS ligando) que suprimen el rechazo de inmunológicamente células dispares ( Fijak y Meinhardt, 2006 ). Privilegio inmune testicular se ha utilizado para explicar el éxito de los trasplantes SSC alogénicos entre individuos competentes no relacionados, inmunes que se había informado anteriormente en varias especies animales grandes (Honaramooz et al., 2002 ; Honaramooz et al., 2003 ; . Mikkola et al, 2006 ; . Kim et al, 2008 ). A pesar de que el número de animales en este estudio no fueron suficientes para demostrar que era necesaria la supresión inmune, nuestros datos indican claramente que las células de los animales donantes compatibles no se toleraban en primates no humanos inmunodeprimidos.

Varias técnicas prometedoras están en fase de investigación (es decir, el trasplante de SSC, injerto de tejido testicular o xenoinjertos, in vitro el desarrollo de los gametos) que pueden permitir a los pacientes que reciben terapias gonadotóxicos para preservar su fertilidad futura ( Brinster, 2007 ; Rodríguez-Sosa y Dobrinski de 2009 ; Sato et al., 2011 ). Trasplante SSC tiene el potencial único para regenerar la espermatogénesis en el ambiente autólogo de los túbulos seminíferos, lo que permite el macho destinatario para padre a sus propios hijos genéticos, posiblemente a través de coito normal. Al igual que con la hematopoyesis, grandes modelos animales que son relevantes a la anatomía y fisiología humana serán importantes para la traducción de la técnica de trasplante de SSC a la clínica de fertilidad humana. Teniendo en cuenta la regeneración exitosa de la espermatogénesis en el modelo de primate no humano reportado aquí y el hecho de que los pacientes que ya están preservando los tejidos y / o células de testículo, la traducción clínica de la técnica de trasplante SSC parece inminente. El desarrollo responsable de la tecnología en un sistema de primates no humanos clínicamente relevante ayudará a abordar las cuestiones de seguridad y la viabilidad. Al igual que con la hematopoyesis, en última instancia, se establecerán el significado clínico y la amplitud de las aplicaciones para el trasplante SSC en pacientes humanos.

Procedimientos experimentales

animales

Todos los experimentos que utilizan animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional responsables de Magee-Womens Research Institute y la Universidad de Pittsburgh (Aseguramiento # A3654-01) y el Consejo Nacional de Investigación de Primates de Oregon Center, Oregon Health & Sciences University (Aseguramiento # A3304 -01) y realizado de acuerdo con los Institutos nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio.

Preparación de donantes macacos rhesus suspensiones de células de testículo

Tejido testicular se recogió de macacos rhesus por hemicastration o biopsia subcapsular. Para biopsias, se eliminó menos del 30% del parénquima testicular (3,8 g-8,7 g) a través de una incisión transversal en la túnica albugínea en el lado lateral del testículo derecho. En un caso (M036), el testículo biopsia se retiró más tarde por hemicastration debido a la formación de un absceso. Las células se recuperaron de parénquima testicular usinga procedimiento de digestión enzimática de dos etapas, criopreservado y almacenado en nitrógeno líquido, como se describe ( Hermann et al., 2009 ; Hermann et al., 2007 ).

El tratamiento con busulfano

Los animales receptores se trataron con la alquilación de busulfán agente quimioterapéutico (Busulfex IV; PDL BioPharma, Fremont, CA), a dosis de 8, 10, 11, o 12 mg / kg ( Tabla S2 ). Busulfex se diluyó en solución salina fisiológica y se administró por vía intravenosa a 0.6 mg / ml durante 10-20 minutos.

trasplantes de CMSP

Se emplearon los trasplantes autólogos de células madre de sangre periférica (PBSC) para restaurar el sistema hematopoyético después del tratamiento busulfán. En pocas palabras, PBSC se movilizaron con seis, inyecciones subcutáneas diarias con las citoquinas de G-CSF (10μg / kg / día, Neupogen; Amgen, Thousand Oaks, CA) y SCF (200μg / kg / día; Amgen) o G-CSF solo ( 20 microgramos / kg / día), esencialmente como se describe ( Figura 2 ) ( Donahue et al., 2005 ). Colecciones de CMSP se realizaron mediante aféresis utilizando un dispositivo de aféresis o Spectra Spectra Optia (BCT Caridian; Lakewood, CO). Veinticuatro horas después de la aféresis, los animales fueron tratados con busulfán y 18 horas después, los animales recibieron transfusiones de CMSP autólogas ( Figura 2 ). Dos días más tarde, los animales recibieron una inyección subcutánea de G-CSF de acción prolongada (300μg / kg; Neulasta, Amgen). Los detalles adicionales están disponibles en Métodos Complementarios .

Histología

Las porciones del parénquima testicular y epidídimo recogidos arriba y en la necropsia se fijaron con solución de Bouin (Accustain; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), embebidos en parafina, se seccionaron (5μm), y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

trasplante de SSC

Los trasplantes de células madre de espermatogonias se llevaron a cabo de 9-15 semanas después del tratamiento busulfán (autólogo – unilateral; alogénico – bilateral). En los animales de la biopsia, los trasplantes autólogos se realizaron en el testículo contralateral. Se recuperaron las células del donante para el trasplante criopreservados del almacenamiento en nitrógeno líquido, tal como se describe ( Hermann et al., 2009 ;Hermann et al., 2007 ). En algunos casos, se enriquecieron las células del donante de espermatogonias, incluyendo las ESC, en un cojín de Percoll 24% (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) antes del trasplante (ver Figura S1 y el cuadro S2 ). Las células fueron suspendidas en aproximadamente 100 x 10 6células / ml en medio de MEMalpha (Invitrogen) que contiene 10% de FBS, 20% de azul de tripano, Optison 20% (agente de contraste de ultrasonido; GE Healthcare, Waukesha, WI) y 0,7 mg / ml de DNasa I en un volumen total de 1 ml ≤, dependiendo del tamaño de los testículos receptor y células disponibles. SSC trasplantes se realizaron mediante inyecciones rete testis guiadas por ultrasonido ( Figura 1 y la película S1 ).Para este fin, una sonda de 13 MHz superficial lineal se utiliza para visualizar el espacio rete testis en una máquina de ultrasonido MicroMaxx (Sonosite, Bothell, WA) y guía de la aguja espinal un 25Ga 2 ‘en la rete testis. Las células fueron inyectadas a presión constante lento y persiguieron con solución salina.

tratamiento Lentiviral de células de testículos de donantes

Para los trasplantes autólogos, las células donantes fueron tratados con vectores lentivirales modificados a partir del constructo FUGW descrito originalmente por Lois y compañeros de trabajo ( Lois et al., 2002 ).Los detalles de las construcciones de virus y tratamientos virales están disponibles en Métodos Complementarios .

Inmunosupresión

Cinco de los seis receptores de trasplantes alogénicos fueron tratados con humano / ratón quimérico anti-CD154 IgG 5C8 (NIH no humano Primate Reactivo de recursos, el Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA) a 20 mg / kg en d-1, D0, D3, D10, d18, d28 y después mensualmente para bloquear la ruta de co-estimuladoras de células T y prevenir de células T mediada por el rechazo de las células injertadas ( Kirk et al., 1999 ).

recopilación y análisis de semen

Las muestras de semen se obtuvieron de animales de experimentación a intervalos semanales antes y después del tratamiento con busulfán, tal como se describe ( Gould y Mann, 1988 ). El recuento total de espermatozoides por eyaculado se determinó mediante hemocitómetro. ADN genómico fue extraído de muestras de esperma y evaluado para el genotipo donante mediante PCR para la secuencia de lentivirus o por la huella de ADN microsatélite (ver Métodos Suplementarios ).

la huella de ADN microsatélite

Se utilizó ADN genómico aislado de los espermatozoides de los trasplantes alogénicos o amplificado a partir de embriones para la toma de huellas dactilares de microsatélites de repetición (detalles en los Métodos Suplementarios ). Primer secuencias y concentraciones de cebador de PCR multiplex se describen en otro lugar ( Larsen et al., 2010 ).

Cuantitativa polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) genotipado

Discriminación alélica a base de sonda TaqMan qPCR se utilizó para detectar un nuevo SNP en la clase rhesus II de histocompatibilidad principal transactivador complejo (CIITA) locus que distingue el ADN genómico del donante (M092) y el receptor (M027) de un trasplante de SSC alogénico esencialmente como se describe ( Alizadeh et al., 2002 ; . Kim et al, 2008 ). Ver Métodos Complementarios para obtener detalles adicionales.

ICSI, el cultivo de embriones y la amplificación de todo el genoma

La estimulación ovárica controlada se realizó en dos macacos rhesus hembra, como se describió previamente ( Byrne et al., 2007 ). Los oocitos fueron recogidos y fertilizados con esperma M027 por ICSI, y los embriones resultantes se cultivaron como se describe ( Hewitson et al., 1999 ; Mitalipov et al., 2006 ). Tras la ICSI y in vitro el desarrollo, los embriones individuales se colocaron en agua 8ul libre de nucleasa. El ADN genómico de cada embrión se amplificó utilizando el WGA4 GenomePlex® de los organismos unicelulares kit de amplificación del genoma entero de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma-Aldrich) y se utiliza para la huella dactilar de ADN microsatélite. Detalle adicional está disponible en Métodos Complementarios .

Fuente: ncbi.nlm.nih.gov

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